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高效液相色谱常见问题与解答

   发布于:2020-09-20 13:22

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  主营产品:济南气相色谱仪,济南液相色谱仪,济南色谱工作站,济南发生器,济南色谱柱

  答:“反相”和“正相”的概念是液相色谱法早期提出的概念,当时键合相色谱柱尚未出现,固定相被涂覆在载体表面,极易流失,为此科学家对流动相使用给出了合理的建议:流动相极性与固定液极性应具有较大差别,以减少固定液流失。固定相极性弱于流动相时的液相色谱法被称为反相色谱法,固定相极性强于流动相时的液相色谱法被称为正相色谱法。尽管目前键合相色谱柱已成为主流,但这一概念在色谱方法开发、预测出峰顺序等方面具有重要意义。

  由上面的介绍可知具体的色谱方法、色谱柱属于正相还是反相不仅取决于固定相极性,同时还取决于流动相极性。C18(硅胶键合十八烷基硅烷)、C8(硅胶键合辛基硅烷)、PH(硅胶键合苯基硅烷)等色谱柱,由于固定相极性极低,比目前已知的任何流动相的极性都要低,因而是标准的反相柱;Silica(硅胶)、NH2(硅胶键合氨丙基硅烷)具有较高的极性,主要用于分离带有极性基团的化合物,所用流动相的极性通常低于这些固定相,因而是标准的正相柱。CN(硅胶键合腈丙基)的极性适中,当流动相极性超过CN时,它属于反相柱,反之则是正相柱。

  答:色谱柱内径决定载样量,载样量与内径的平方成正比;色谱柱长度与塔板数成正比,与柱压成正比;粒径影响涡流扩散相,粒径越小涡流扩散相越小,柱效越高,粒径与柱效近似成反比;粒径越小,压力也越大,压力与粒径的平方成反比。填料孔径对分析对象的分子量有限制,当孔径为分析物尺寸的5倍以上时,分析物才能顺利通过孔隙,孔径处于60~120 的色谱柱适用于相对分子量小于10000的分析物,孔径为300 的色谱柱可以满足分子量处于10000以上的大分子化合物分析。

  N:柱效(Efficiency)反映色谱柱性能,柱效越高,分离度越好。在其他条件恒定的情况下,塔板数增加一倍,分离度仅提高40%。操作中,可通过下面两种方式增加塔板数进而提高分离度:其一,使用长柱或双柱串联,但也会使分离时间大大延长;其二,使用细粒径填料的色谱柱,但这需要耐更高压力的液相色谱系统。相比之下后者更为可取。

  :选择性(selectivity)是指色谱柱-流动相体系分离两个化合物的能力。选择性主要与固定相、流动相组成以及柱温等因素有关,与保留值也密切相关,其中固定相和流动相组成影响较大。以*常见的反相模式为例,反相柱(包括C18、C8、PH等)是以分配作用对化合物进行保留的,不同化合物的分离是基于它们在键合相与流动相中分配系数的差异,如果两种化合物的水溶性、在烷烃-水体系的分配系数等方面存在明显差异,那么这些化合物通常是能够利用反相柱达到分离;PH柱对具有苯环的化合物具有特殊保留。正相模式下,硅胶柱、胺基柱、氰基柱与带有极性基团的化合物之间存在极性相互作用,对化合物的基团具有选择性,常常用于结构类似物、异构体化合物的分离。流动相方面,降低流动相的洗脱强度通常可以增大分离度;而有机溶剂类型也会影响分离,比如反相条件下,乙腈和甲醇的选择性就存在很大差异,这种差异需要在实践中摸索,但无论如何,多种溶剂类型带给我们更多的实现分离的可能。

  k:随着容量因子k的增大,分离度也随之增加,这种影响在k值较低时非常明显,当k值大于10时,k值增加对分离度的影响就不再显著,这就告诫无原则地提高k值以增大分离度是没有意义的。增加键合相密度能够提高k值;另外改变键合基团类型也能改变k值,比如在反相色谱中,随着键合相碳链长度的增加,k值逐渐增大。

  理论上讲,色谱峰应符合高斯曲线分布,然而实际上任何色谱峰都对高斯曲线分布存在一定的偏离,亦即不对称。峰拖尾可以用不对称因子(As)或USP拖尾因子(Tf)来衡量,显然不对称因子的说法更准确,因为色谱峰存在前延、完美对称、拖尾三种形态。一般来说,制药行业以USP拖尾因子作为评测标准,而其他行业则多采用As来测定峰形。

  对于药物分析,通常有明确的规定,Tf应处于某一范围之间,比如我国药典规定某些药物的拖尾因子应处于0.95~1.05之间。其他行业尚无较为明确的规定。

  答:为了改善分析结果,某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以连续改变流动相的极性,使每个分析组分都有合适的容量因子k,并使样品种的所有组分可在*短时间内实现*佳分离,这种洗脱方式称为梯度洗脱。

  C 样品含有强保留的干扰物,在目标化合物出峰后设置梯度洗脱,将干扰物洗脱出来,以免其影响下一次数据采集。

  D 分析方法建立时,不知道其洗脱情况,使用梯度洗脱,找出其较优的洗脱条件。

  硅胶表面的硅羟基(Si-OH)密度为8 mol/m2,由于空间位阻的存在,硅烷化键合反应*多只能覆盖50%的硅羟基,超过一半的硅羟基是活性硅羟基。这些硅羟基与化合物的极性基团存在极性相互作用和离子交换作用,为化合物的保留增加了不被期望的作用力,往往会影响峰形。用短链氯硅烷(如三甲基氯硅烷)键合活性的硅羟基,可以减小甚至消除这种影响,这种操作被称为封端(Endcap)。

  通过空间位阻掩盖了键合反应形成的Si-O-Si键,使其对酸性环境的耐受性增强;

  柱床塌陷是指色谱柱使用一段时间后色谱柱入口处的柱床产生可见的空隙。该空隙的存在增大了死体积,会导致色谱柱柱效下降。造成柱床塌陷的原因如下:其一,色谱柱填装时的压力过低,填装不紧密,在高压下使用一段时间,开始出现空隙;其二,操作压力超出色谱柱填料的耐压值,导致填料颗粒破碎产生空隙;其三,流动相溶解填料导致空隙出现。键合相塌陷是指由于流动相极性与键合相极性相差太大,键合相无法在流动相中充分伸展而倒伏、缠结在一起,比如普通C18在纯水相

  使用者通过观察的系统监测掌握系统的压力,如果发现压力偏高,不要立即认为“柱压高了”,因为系统压力通常由柱前压力、色谱柱压力和流通池压力加合而成。此时正确的做法是:在操作条件下,测定系统压力,得到p总;卸下色谱柱,在相同条件下,测定柱前压力,得到p前;用两通将泵流出管路与流通池连接,在操作条件下,测定压力,得到p(前+后)。通过计算找出压力高是来自柱前、色谱柱还是柱后。

  以上情形假设没有安装保护柱,如果安装了保护柱,压力升高时应先测试保护柱的压力,以便确认问题是否来自保护柱。

  通常情况下,泵压的变动值超过了0.5 Mpa,系统压力就属于不稳定的范畴。导致系统压力不稳定的*直接原因为流动相流量和组成输出的不稳定,而导致流动相输出不稳定的原因通常包括溶剂互容性较差、系统漏液、系统存在气泡以及输液系统部件工作失效等等。下面将介绍排除“系统压力不稳”的方法。

  流动相输出不稳定还会导致基线不稳定以及保留时间变化等现象,所以基线不稳定或保留时间不重现时,先看一下柱压是否稳定,如果不稳定,三个问题可以合并处理。

  基线不稳定是指色谱曲线在较长时间范围内对响应值的0刻度较大的偏离,通常包括基线漂移(单方向)、基线起伏(规律的上下起伏)、区域宽度极大的色谱峰三种情况

  如果基线不稳定同时伴随压力波动,请按照“压力不稳定”进行排查。如果压力稳定,请按下表中的方法进行排查。

  噪声(baseline noise):由检测器输出与被测样品组分无关的无规则波动信号,在特定灵敏度下用响应单位表示。可分为高频噪声和短周期噪声两种。对于光谱型检测器,噪声的正常响应值处于0.000005 V ~ 0.00002 V之间(参考Shimadzu 的HPLC仪器),高于此值,即可认为噪声偏高。

  柱性能下降的一个重要现象就是在保留时间基本不发生变化的情况下,色谱峰的区域宽度明显增大(如下图)。

  当保留时间的偏差超过2%,可以认为保留时间的重现性差。对于某一个特定的分析,保留时间主要受流动相组成、流速、温度以及固定相影响,当保留时间发生明显变化时,应从这几方面入手。

  理想的色谱峰遵循正态分布,应该符合高斯曲线,是完美而对称的峰形(如图A);然而由于化合物性质的特殊性、色谱柱故障、操作条件等问题存在,峰形可能会不对称,前延(B)或拖尾(C)。

  中药成分分析项目中,提取溶剂通常为乙醇、甲醇、乙酸乙酯等洗脱强度较强的溶剂,此时易发生“样品溶剂的洗脱强度远远超过流动相”的情况,为避免前延峰出现,可以用通过“流动相稀释提取液”或降低“进样体积”的方式。

  气泡峰是指携带气泡的流动相通过检测器时得到的响应值;这里的气泡可能是流动相中释放的空气,也可能是有机相遇水放热而会释放的有机溶剂分子;气泡峰往往具有较高的响应值,区域宽度仅为数秒,出峰时间和相应值比较有规律(如下图)。通常只有光谱型检测器才会出气泡峰。

  对于预先混合的溶剂,混合后脱气,排除溶解的空气和因放热而挥发出的有机溶剂分子;

  前面的脱气方式对于预先混合好的混合溶剂,基本可以达到消除气泡峰的目的;但对于多种纯溶剂在仪器中混合的情况,混合后溶剂体系放热,存在潜在的气泡,当流动相流出色谱柱时,压强骤减,潜在的气泡溢出,被检测器检测到。为了防止这一问题出现,应在检测器出口连接一段内径较细的管路,使流动相通过检测器时,环境压强较高,气泡难以溢出,可以避免气泡峰出现。

  目标化合物(Aimed Compounds):想要从复杂的样品基质中分离出来的化合物;

  基质(Matrix):目标化合物所处的样品环境,基质中通常含有大量干扰物;

  干扰物(Interferential Compounds):影响目标化合物分析或能够对分析仪器造成损害的化合物,通常是对基质中除目标化合物以外所有化合物的统称;

  吸附剂(Sorbent):固相萃取柱中的填充物,能够从样品溶液中选择性地萃取某些化合物;

  吸附容量(Capacity):在特定条件下,一定质量吸附剂能够保留的化合物(包括目标化合物和部分干扰物)的总质量;

  选择性(Selectivity):吸附剂区别对待目标化合物和所有其它样品组分的能力,也就是保留目标化合物而排除其他组分的能力,高的选择性可以获得更佳的净化效果;

  pH :溶液中质子(H+)浓度的负对数,该值越小表明溶液中质子的浓度越大;

  pK a :酸性化合物解离常数(K a)的负对数,该值越小酸性化合物的解离性越强,当样品溶液的pH 值与pK a 相等时,未解离态化合物与解离态化合物浓度相等;分析人员也常用pK a 表示碱性化合物的解离性,但此时的pK a 值表示的是碱性化合物共轭酸的解离常数的负对数,该值越大表明碱性化合物结合质子的能力越强,碱性也越强;

  相互作用(Interaction):在特定的化学环境中,两种化学物质之间(比如目标化合物与吸附剂之间、目标化合物与溶剂分子之间)发生的吸引或排斥等作用力;

  非极性相互作用(Non-Polar Interaction):目标化合物上的非极性官能团与非极性吸附剂之间的作用力,这种作用力在极性溶剂环境尤其是水环境中才能较好体现,因而也称疏水相互作用,比如水环境中,邻苯二甲酸酯类化合物与C18 之间的作用力;

  极性相互作用(Polar Interaction):目标化合物上的极性官能团与吸附剂上的极性官能团之间的作用力,这种作用力在弱极性或非极性溶剂环境下才能较好的体现;

  离子相互作用(Ion Interaction):离子型目标化合物上的离子官能团与吸附剂上带有相反电荷的官能团之间的库伦力;

  次级相互作用(Secondary Interaction):对于反相硅胶键合吸附剂,颗粒表面残余的硅羟基会与极性化合物发生极性相互作用,并且部分硅羟基解离后会与碱性化合物发生离子相互作用,相对于非极性相互作用这些作用力处于次要地位,因而被称为次级相互作用。次级相互作用是反相硅胶吸附剂所不期望的,通常可以通过封端技术(Endcaping)加以消除;

  活化(Activation):也称溶剂化,加入合适的溶剂使吸附剂上的官能团展开,并除去吸附剂上可能存在的干扰物,对于反相吸附剂常常用中等极性溶剂(比如甲醇),正相吸附剂常常用弱极性或非极性溶剂(比如己烷);

  平衡(Equilibrium):除去活化溶剂为上样创造适宜的溶剂环境,所用溶剂通常与样品溶液的溶剂一致;对于离子交换柱,如果样品是碱性化合物平衡液中往往需要加入酸,如果样品为酸性化合物平衡液中往往需要加入碱;

  保留(Retention):当样品溶液通过吸附剂,吸附剂与某些化合物的作用力超过后者与溶剂的作用力时,这些化合物就会被吸附剂固定,该过程称为保留;

  淋洗(Washing):上样后,部分干扰物与目标化合物同时被保留,需要加入合适的溶液以可能地除去干扰物而不影响目标化合物的保留,通常情况下用上样时的样品溶剂淋洗不会影响回收率,但洗脱强度较大的溶剂能程度地去除干扰物,选择淋洗液时需要在回收率和净化效果间找到平衡点;

  洗脱(Elution):让洗脱能力较强的溶剂通过吸附剂,打断吸附剂与被保留的化合物之间的作用力,使这些化合物随溶剂从吸附剂中流出;通常情况下,能刚好洗脱目标化合物的洗脱溶剂是*佳选择,此时洗掉的干扰物*少,选择洗脱液时也需要在回收率和净化效果间找到平衡点;

  穿透(Breakthrough):吸附剂的保留能力较弱或化合物的质量超过吸附剂容量时,在上样过程部分或全部目标化合物未被保留即流出小柱的现象;该现象属于操作事故,应避免发生。

  “亲水亲脂平衡”(Hydrophilic Lipophilic Balance,HLB),起初用以表示“表面活性剂分子中的亲水基团与亲油基团的平衡关系。”21世纪初,“亲水亲脂平衡”理念被引入SPE,其填料基质为聚合物(比如聚苯乙烯),基质具有亲脂性,与C18功能类似,具有反相保留功能;然后在聚合物基质上键合极性基团,比如吡咯烷酮,具有亲水性,该基团能够增强填料对极性化合物的保留能力,并使填料保持水可润湿性防止柱床干涸,提高了结果稳定性;

  迪马科技推出的ProElut PLS兼具亲水基团(吡咯烷酮基团)和疏水基团(二乙烯基苯),对极性化合物和非极性化合物均有较好的保留,具有亲水亲脂平衡的特性。与之相同的小柱还有Waters Oasis HLB。

  A 真正的通用性:对亲水物质和亲脂物质具有均衡的保留能力,应用领域覆盖了非极性、弱极性极性化合物,克服了C18 吸附剂对极性化合物保留较差的缺点;

  B 更高的稳定性:具有水可润湿性,填料经活化后,即使柱床干涸,吸附剂对目标物的保留也不会发生变化;

  C 更宽的pH 值适用范围:PLS 的基质为有机聚合物而非硅胶,在pH 0-14 的范围内表现稳定,而硅胶键合吸附剂只有在2-7.5 的范围内是稳定的;

  D 更高的吸附容量:可保留更多的目标物,有效地防止了“穿透现象” 的发生,提高了重现性;

  E 不存在次级相互作用:硅胶键合吸附剂的表面存在未键合的硅羟基,对碱性化合物的保留较强,用硅胶键合吸附剂处理碱性化合物,回收率通常较低;PLS 是有机聚合物基质的吸附剂,不存在次级相互作用,用于碱性化合物能够得到满意的结果。

  在一次完整的SPE 操作中,目标化合物可能会存在于样品溶液流出液、淋洗液、洗脱液或吸附剂中,当“目标物没有回收或回收率低” 现象发生时,可向样品溶液加入标液,然后进行完整的SPE 操作并将样品流出液、淋洗液和洗脱液分别收集并分析,首先确定目标化合物存在于哪一部分,进而确定问题来自下列哪一环节:

  A 当超过5% 的目标化合物出现在样品流出液或淋洗液时即可断定“目标化合物在吸附剂上的保留不足”。下面是具体原因的改进办法:

  B 当目标化合物在样品溶液流出液和淋洗液中未出现而洗脱液中仅有少量或未出现时,可判断“目标物未被完全洗脱”。

  C 如果目标化合物在洗脱液中正常出现,那么回收率不足的问题应该来自样品前处理的其他环节。

  通常而言采用保留目标化合物的模式比保留杂质的模式净化效果好,如果正在分析的项目为某一种或某一类化合物分析,是采用保留目标化合物的净化模式;举一个简单的例子,同样是分析蔬菜中的多菌灵和噻菌灵( 一类碱性农药),使用阳离子交换柱可以专一性地保留这些农药,使它们基本与干扰物完全分离,而使用正相吸附剂或石墨化碳黑进行保留干扰物的操作仅能把主要的干扰物除去,仍有较多干扰物存留。

  另外,如果不止一种SPE 柱可用于目标化合物的净化时,应挑选选择性好的吸附剂;选择性方面,离子交换>正相>反相。

  对于反相模式和正相模式,应在不影响回收率的前提下,增大淋洗液洗脱的强度并降低洗脱液的洗脱强度。

  对于反相模式,可将目标化合物的水溶液上样,然后依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 的甲醇水溶液洗脱,分别收集洗脱液分析,建立淋洗曲线,找出目标化合物被洗脱时的溶剂体系,淋洗液中甲醇的含量应稍低于目标化合物恰好被洗脱时的溶剂体系,而洗脱液中甲醇的含量应稍高于目标化合物恰好被完全洗脱时的溶剂体系;当纯甲醇不能洗脱目标化合物时,应试验甲醇- 甲基叔丁基醚混合溶液的洗脱曲线;对于某些既不溶于水也不溶于甲醇的离子型化合物,可以在溶剂体系中加入酸或碱。

  对于正相体系,可将目标化合物的正己烷溶液上样,然后依次用5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100% 的正己烷甲基叔丁基醚溶液洗脱,分别收集洗脱液分析,建立淋洗曲线,找出目标化合物被洗脱时的溶剂体系,淋洗液中甲基叔丁基醚的含量应稍低于目标化合物恰好被洗脱时的溶剂体系,而洗脱液中甲基叔丁基醚的含量应稍高于目标化合物恰好被完全洗脱时的溶剂体系。

  SPE 柱中的吸附剂可能存在少量干扰物,有效地活化可以避免这些干扰物进入洗脱液,活化溶液应选择整个操作中洗脱强度*强的溶剂体系;在反相模式中,从样品溶液到洗脱液主要涉及0%-100% 甲醇水溶液,所以活化溶液应选纯甲醇,当目标化合物需要用甲醇-甲基叔丁基醚混合液洗脱时,活化溶液应选甲基叔丁基醚;在反相模式中,从样品溶液到洗脱液主要涉及0%-100% 正己烷- 甲基叔丁基醚溶液,所以活化溶液应选纯甲基叔丁基醚。

  老化的目的:气相色谱柱的固定相通常是以涂覆的形式分布在柱管管壁内侧(毛细管柱)或载体表面(填充柱)上的,对于一根新的

  气相色谱柱,外层固定相与载体的结合往往较弱,在高温下使用会缓慢流失,造成基线起伏和噪声升高,为了避免这一现象发生,

  可以预先在较高温度下(一般为色谱柱的耐受温度)加热一段时间,使结合较弱的固定相挥发出去,从而使后面的分析不受干

  扰。此外,对使用时间较长的气相色谱柱可进行老化操作,可以除去色谱柱中残留的污染物。

  将色谱柱柱温升至一恒定温度,通常为其温度上限。特殊情况下,可加热至高于操作温度10-20 C 左右,但是一定不能超

  过色谱柱的温度上限,那样极易损坏色谱柱,此外不要将程序升温的速度设定的太慢。当达到老化温度后,记录并观察基线。比

  例放大基线,以便容易观察。初始阶段,基线应持续上升,在到达老化温度后5-10 分钟开始下降,并且会持续30-90 分钟。当

  达到一个固定的值后,基线 小时后基线 分钟后仍无明显的下降趋势,那么有可

  能系统装置有泄漏或污染。遇到这样的情况,应立即将柱温降至40C 以下,尽快地检查系统并解决相相关的问题。如果还是继

  续地老化,不仅对色谱柱有损害,而且始终得不到正常稳定的基线。另外,老化的时间也不宜过长,不然会降低色谱柱的使用寿

  一般来说,涂有极性固定相和较厚涂层的色谱柱老化时间较长,而弱极性固定相和较薄涂层的色谱柱所需时间较短。而PLOT 色

  谱柱的老化方法又各不相同,具体步骤请参阅随柱子的操作说明书。如果在色谱柱没有与检测器连接就进行老化,那么老化后,

  谱柱末端部分可能已被破坏。要先把柱末端10-20cm 部分截去,再将色谱柱连接到检测器上。

  温度限定是指色谱柱能够正常使用的应用温度范围。如果操作温度低于色谱柱的温度下限,那么分离效果和峰形都不会很理想。

  但这样对色谱柱本身并无什么损害。温度上限通常有两个数值。数值较低的是恒温极限。在此温度下,色谱柱可以正常使用,而

  且无具体的持续时间限制。较高的数值是程序升温的升温极限。该温度的持续时间通常不多于十分钟。高于温度上限的操作则会

  在GC 中使用程序升温时常常会出现基线漂移的现象,这种现象通常有以下几个原因:色谱柱流失、进样垫流失、进样器污染

  或检测器污染、气体流速的变化。如果使用高灵敏度检测器,即便是微弱的柱流失或系统污染都可能带来显著的基线漂移现

  首先把柱子从色谱仪上取下,堵住检测器的入口,再观察在程序升温时基线的漂移情况。如果基线不稳,那么污染来自检测器

  (解决办法请参考“如何降低检测器的污染”) ;如果基线是稳定的,证明检测器良好,此时用一小段熔融石英管把进样器

  和检测器连接起来,走一个升温程序,观察基线漂移情况,此时反映的是进样器的污染情况,如果基线不稳,可以确定问题来

  自进样口(解决办法请参考“如何降低进样器的污染” );如果基线稳定,证明检测器和进样口均未被污染,此时把柱子重新装

  上,走同样的升温程序,来确定是不是柱子流失带来的基线 如何降低样品和进样器带来的基线漂移?

  色谱柱上如果有高分子不挥发性物质残留,那么在程序升温时就容易产生基线漂移,因为这些物质的保留较强,在柱中移动缓慢,可以采用重新老化的方法将这种强保留组分从柱子上赶出,但这种方法增加了固定液氧化的可能性;此外,还可以使用溶剂冲洗色谱柱(冲洗之前请阅读柱子的使用注意事项,以便选出合适的溶剂);也可以安装保护柱,这样可以预防问题发生。如果是进样器被污染造成基线漂移,可以通过更换进样垫、衬管和密封圈来解决,同时用溶剂冲洗进样口,维护完毕之后,用

  由检测器带来的基线漂移通常是由补偿气或者燃气当中少量的烃类物质引起的,使用高纯气体净化器处理补偿气或者燃气可以减少这种基线漂移;使用高纯气体发生器可以改善FID 的基线稳定性;正确的检测器维护,包括定期的清洗,都可以减少这种漂移。

  在使用新柱之前,按照以下方法老化可以使柱流失降到:用高于实验操作温度20 或者用色谱柱的操作温度(使用两者中较低者)来老化,长时间低温老化相对于短时间高温老化有利于降低色谱柱流失。

  如果在载气当中含有少量的氧气或者水分或者气体管路漏气,在高温条件下,固定液就容易被氧化,从而造成柱流失,带来基线

  漂移。一旦固定液被氧化,必须使用高纯载气老化数小时,才有可能使基线趋于水平,这种对固定液的破坏是无法弥补的,所以如果有氧气连续通过色谱柱,即便进行老化基线也无法降到水平。因此,在实验过程中,应在气体管路当中使用高质量的氧气/水分过滤器,同时用高质量的电子检漏仪严格检漏。

  毛细管色谱柱的选择Agilent 气相色谱仪噪音异常的解决方法美国药典(USP)规定的色谱柱编号对应表

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